胰岛移植和干细胞移植的治疗进展
作者：石家庄平安医院糖尿病科 发布时间：2010-4-3 10:26:06 点击数：445
糖尿病是常见的内分泌代谢疾病。其中I型糖尿病，即胰岛素依赖型糖尿病（IDDM）发病多在青少年，发病时体内胰岛迅速破坏，胰岛素严重不足，必须长期依赖外源性胰岛素治疗，但长期使用胰岛素也会产生诸如肥胖等并发症，并且每天注射胰岛素本身也给病人带来很大的痛苦。同时，监测体内血糖水平，调整胰岛素注射剂量也是让医生和病人都感到颇为麻烦的一件事。为消除这些副作用，多年来人们一直在尝试用活体胰岛移植来代替单纯注射胰岛素。
胰岛的分离、纯化和培养
胰岛的来源是胰岛移植的首要问题，也是胰岛移植的核心所在。无论同种异体或是异种胰岛移植，首先要求获得足够量的活力良好的胰岛，因此，如何更高效地获取大量可供移植用的胰岛一直是医生关注的问题。
1） 胰岛的分离：
胰岛的分离实际上是把一个器官（胰岛）从另一个器官（胰腺）中完整地分离出来的过程。胰腺组织中主要的细胞外基质成分为I、III、IV型胶原、III型前胶原、层粘连蛋白和纤维粘连蛋白。单纯采用机械的方法分离胰岛早期也曾见诸报道[1]。也有人尝试用胰酶消化分离胰岛，但结果发现其分离效率很低，且会抑制胰岛细胞分泌胰岛素的功能[2]。1964年，Moskalewski首次报道用胶原酶消化法分离猪胰岛细胞取得成功[3]，随后经过不断的改进，该方法日趋成熟并成为主流。迄今为止，胰岛的分离主要采用胶原酶消化法。胶原酶是金属蛋白酶的一种，能够在生理条件下水解胶原组织的三螺旋区域，其活性的发挥需要金属离子锌和钙。胶原酶可以通过注射或灌注的方式导入腺体组织中，后者比前者产量略高。通常情况下，选择经胰腺导管途径给药可以获得较高的胰岛产量。但无论采取哪种方式，都要保证胶原酶到达所有胰腺组织，膨胀不好的区域胰岛不会获得很好的分离。经验表明，40mmHg的灌注压力比较合适，如果压力过大，则酶会进入到胰岛内部。在灌注时机上，应当说越早越好，如在冷缺血之前即灌注，则效果最佳，不过此时最好把胶原酶预先4℃储存，保存在无活性状态。消化时，再逐渐升温至39℃，甚至到41℃，当然也可以低温长时间消化，如20℃48小时[4]。
将胶原酶消化与机械分离的方法结合起来可获得更理想的分离效果。Recordi C等研制了一种人胰岛的自动分离装置[5]。应用该装置可以A.最大程度地减小机械外力对胰岛造成的损伤；B.连续消化，消化下来的胰岛随时收集起来，避免了进一步的消化损伤；C.操作人员不介入消化过程；D.胰岛产量高，纯度好。国内也有人采用自制的类似装置，取得了较好的效果[6,7]。
2) 胰岛的纯化
经消化分离而获得的胰岛细胞团中还大量分布着胰腺的腺泡细胞等非胰岛成分。通常用EuroFicoll或Nycodenz溶液将Ficoll配制成为一定的密度梯度或范围，采用连续或不连续的密度梯度离心法纯化胰岛成分。在Tze[8]的Ficoll间断密度梯度离心法中，先将Ficoll配成23%（1.108g/ml）、20%（1.096g/ml）和11%（1.037g/ml）的不连续密度梯度，再将胰腺消化物沉淀与4ml最高密度的Ficoll混合，在此悬液上按照密度由高到低的顺序依次缓慢加入相应密度的Ficoll 2ml，另加Hanks液2ml，经4℃3000rpm离心15分钟，吸出各浓度界面的细胞团，经Hanks液洗涤2次，过45µm滤网，除掉单细胞和不完整的胰岛组织，即得纯化的胰岛。在连续密度梯度离心法中，将Ficoll配成1.095~1.055g/ml的连续密度梯度，离心状态下缓慢注入消化后的细胞悬液，30分钟后终止离心。而后分段收集，分别取样做双硫腙染色，于光镜下观察，选择含完整胰岛的离心管，离心收集沉淀，在Hanks液中重悬后过45µm滤网，即得纯化的胰岛。粗略的纯化也可采用Hinshaw法[9]。胰岛活性鉴定采用台盼蓝染色法，胰岛的特异性鉴定采用双硫腙（DTz）染色法。胰岛的纯度以双硫腙染色观察内外分泌部组织量的比值来估计。直径小于50µm的细胞团不计数，并换算成胰岛相当量（Islet Equivalent,IEQ），即直径为50µm以上的胰岛的数量。
3） 胰岛的培养和活性鉴定：
多数文献报道采用RPMI1640培养液，添加10%的血清、100u/ml的双抗等。也有报道采用CMRL1066或Ham F10组织培养基，添加25mmol的HEPES、10%的FCS、100u/ml的双抗等。培养后48小时加入过碘酸可帮助清除混杂的成纤维细胞。
胰岛活性采用胰岛素刺激释放实验测定：即用低浓度和高浓度葡萄糖分别刺激1~4小时，检测培养液中胰岛素的含量。胰岛素测定可采用市售的放免试剂盒。
胰岛的冷冻保存
临床胰岛移植研究表明，一个胰岛受者每1千克体重需要6000个胰岛，因此每个受者需要多个供体提供胰岛，而供体本身非常有限，只能来源于脑死亡的供体，且很难保证同时获得多个配型吻合的供体。基于以上原因，将收集到的胰岛组织进行冷冻保存以便集中应用就变得非常重要。这不仅可以长期保存供体组织，而且可以更容易地从库存胰岛中选择合适的HLA配型。同时，也可以从大量的库存供体胰岛中各取少量胰岛，从而使得移植的胰岛处在受体的免疫识别阈值以下，避免免疫排斥。另外，长期的体外冻存还可以减小供体胰岛的免疫原性。
标准的胰岛冻存方案是用DMSO作为冷冻保护剂，慢冻，速融。实验表明，DMSO作为胰岛冷冻保护剂优于甘油，但对细胞也有毒性和渗透损伤。国内张洪德等研究了应用DMSO冻存胰岛组织的理想条件，发现以1.5mol/L的DMSO作为冻存保护剂，4℃渗透平衡30分钟后再以0.3℃/分钟的速度缓慢降温，复温后0℃倍比稀释逐步透出DMSO，可减少胰岛损伤，提高其存活效率[10]。Miyamoto等[11]发现乙烯二醇（EG）较之DMSO能够更快速地进出细胞，而对细胞不造成损伤，因而将其引入了胰岛的冻存。针对人的胰岛组织量比较多，应用冻存管冻存操作工作量太大，且易于增加细菌污染的机会，他们又用血液冻存袋代替了冻存管。为使降温过程具有更好的可控性，他们又发明了一种计算机控制的降温装置。降温程序为：5℃——-9℃，-1℃/分钟；-9℃——-40℃，-40℃/分钟；-40℃——-25℃，35℃/分钟；-25℃——-60℃，-1℃/分钟；投入液氮。结果发现，胰岛在37℃快速复温后胰岛素刺激释放实验表明胰岛活性良好，在糖尿病小鼠肾包膜下接种后可显著降低小鼠血糖水平，因而是一种简便、有效的冻存方法。
胰岛的微囊化处理
应用胰岛移植稳定胰岛依赖型糖尿病病人的血糖水平，早在1997年的国际胰岛移植登记报告中即有成功的报道，但为克服强烈的移植免疫排斥反应，必须使用大量的免疫抑制剂，结果往往带来很多严重的并发症，如肿瘤发生、感染、肾衰、骨质疏松等。为此，近年来发展了微囊包裹技术（Encapsulation），在胰岛外面包裹一层膜状结构物质，使胰岛与宿主的免疫系统隔离开来，免受宿主的免疫细胞以及免疫大分子的攻击，同时小分子的营养成分、氧气、胰岛分泌的胰岛素等又可以自由进出包囊。应用该技术不仅可以有利于胰岛的异体移植，而且使得动物，主要是猪胰岛资源的利用成为可能。
1980年，Lim等发明了海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠（alginale-polylysine-alginale，APA）微囊包裹技术[12]。其制作方法有两种，包括氮气喷射液滴法和静电液滴法。两种方法工艺类似，都是先将胰岛与海藻酸钠混合（约5000个胰岛/ml海藻酸钠），用氮气喷射液滴法或静电液滴法制备成实体微球，再包被聚赖氨酸、海藻酸钠，并用柠檬酸钠将微囊内胶体液化，以利于物质传递，仅保留一层固体的APA膜。微囊包裹技术发明以来受到了广泛重视，并在原有基础上得到了进一步的发展。由于研究中发现APA膜微囊化胰岛移植后囊周出现纤维化，导致囊内胰岛营养障碍、细胞坏死，因此许多学者研究其它物质作为膜的构成材料。Iwata等[13]应用5%琼脂糖胶作为胰岛包裹材料处理C57BL/6和C3H/He小鼠胰岛，同种移植于链脲霉素致糖尿病的BALB/C小鼠和NOD小鼠，结果在不应用免疫抑制剂的情况下，能有效延长同种胰岛的功能，维持NOD小鼠血糖正常达192天。 高浓度的琼脂糖胶能有效限制抗体和补体的弥散，但浓度高于10%时则过于粘稠，不易形成微囊。为此，Iwate等对原有方法进行改良，发展了一种新型的琼脂糖胶-聚苯乙烯磺酸微囊。以5%的琼脂糖胶作为囊的基本结构成分，以5%的聚苯乙烯磺酸作为聚合物添加剂，外层以聚凝胶处理防止聚苯乙烯磺酸渗漏，最外层包被羧甲基纤维素以增强微囊的生物相容性，应用这种新型琼脂糖胶-聚苯乙烯磺酸微囊化的胰岛移植于NOD小鼠，动物存活并维持正常血糖120天。近年来，又有Lembert N等[14]尝试以聚砜作为微囊包裹材料；Del Guerra S等[15]应用明胶包裹胰岛组织；Pollok JM等[16]在PGA可降解材料包裹的基础上再包裹一层软骨细胞，均取得了较好的免疫隔离效果。但究竟哪一种材料作为微囊化胰岛移植的免疫隔离材料更为理想尚没有见到综合性的比较与分析。国内中科院大连化学物理研究所、军事医学科学院基础所、天津市肝胆疾病研究所、解放军总医院基础所、山东省医科院基础医学研究所、石家庄平安医院分子生物学实验室等多家单位均开展了胰岛的微囊化研究，取得了很好的效果。
胰岛干细胞研究
胰腺在发育过程中其各种类型的细胞均起源于共同的内皮细胞，这些细胞增殖、分化形成各种胰腺细胞，即内分泌细胞、腺泡细胞和导管细胞。研究中发现，在正常的胰腺组织中，有0.01%的导管上皮细胞能够表达胰岛细胞相关激素的基因，并在一定的刺激下经过形态学的变化，形成新生胰岛。这一诱导过程在实验室里可通过大豆胰酶抑制剂，或高浓度的γ-干扰素，或特异性生长因子刺激，也可通过胰腺部分切除或是将胰头用玻璃纸包裹而诱发。1995年，Peck AB等报道从长期培养的胰腺导管上皮细胞中分化出有功能的胰岛组织[17]。他们的培养过程分为4步：1）将人或NOD小鼠的胰腺组织进行不完全消化，分离其导管上皮细胞并在无血清培养基中进行培养，直至细胞铺展成单层生长状态；2）加入糖尿病供体的血清，诱导细胞分化为胰岛细胞前体细胞。细胞团先是出现芽蕾样结构，继而形成球状结构；3）在诱导体系中加入葡萄糖，促进细胞增殖和进一步分化。构成球体的细胞进一步调整细胞的排列，形成胰岛样结构，胰岛素和/或胰高血糖素抗体染色弱阳性；4）体内植入，促进胰岛细胞最终成熟。在体内植入之前，未成熟的胰岛细胞可在培养瓶内维持胰岛样结构数天到数周，且一旦将其分散为单个的胰岛细胞前体细胞，则胰岛形成过程可重新启动，每个亚克隆都能再增殖分化形成胰岛。以此方式，该实验室将所获得的胰岛前体细胞不断扩增，在实验室里维持达2~3年之久。2001年[18,19]又相继报道了他们进一步的研究成果，结果显示，胰腺导管细胞经体外诱导培养后形成的胰岛，含有α、β和γ三种胰岛细胞，表达胰岛细胞相关的分化标志分子，能够对葡萄糖水平作出反应，在糖尿病NOD小鼠体内移植后能够矫正其血糖水平，使动物摆脱胰岛素依赖。由于糖尿病胰腺的导管细胞同样含有胰岛干细胞，因此提示胰岛干细胞的研究和开发对于胰岛素依赖型糖尿病的治疗可能具有潜在的巨大的临床应用价值。
胚胎干细胞也是胰岛的一个潜在的重要来源。McKay Ron[20]领导的课题组采用5阶段处理法诱导胚胎干细胞分化为胰岛细胞。第一阶段——ES细胞扩增（2~3天）：将ES细胞接种到明胶包被的培养板上生长，不用饲养层细胞，但培养液中加LIF。第二阶段——拟胚体（EB）形成（4天）：细胞悬浮培养，培养液中加LIF。此期nestin阳性细胞被富集。第三阶段——nestin阳性细胞的筛选（6~7天）：将EB置于无血清培养基ITSFn中培养。此期其它细胞死亡，nestin阳性细胞比例增加。第四阶段——胰岛细胞前体细胞的扩增（6天）：细胞在N2无血清培养基中培养，培养基中含bFGF，促进细胞分裂，含B27添加剂和bFGF。第五阶段——胰岛细胞的分化和胰岛细胞团的形态发生（6天）：从含有B27和尼可酰胺的N2培养基中撤去bFGF，减弱细胞增殖和分化。在所形成的胰岛样细胞团中，有31.5±6.6%的细胞胰岛素表达强阳性。形成的胰岛对葡萄糖刺激释放胰岛素的反应与原代培养的胰岛一样呈现剂量依赖性。将培养末期的胰岛移植到链脲霉素诱导的糖尿病小鼠皮下，发现其呈现正常胰岛的形态，能够血管化，且能够维持动物体重，显著延长糖尿病小鼠的生存时间。该研究不仅为胰岛发育提供了很好的研究模型，而且也为人类应用胚胎干细胞治疗糖尿病带来了新的曙光。运用ES细胞培育与受体组织具有免疫相容性的胰岛组织进行体内移植将会克服免疫排斥、供体资源匮乏等一系列现有的障碍。
胰岛移植的临床应用
有关胰岛移植的临床实践国内外多有报道。迄今为止最成功的胰岛移植的临床报告来自于加拿大Edmonton中心[21]，该中心在2000年7月的新英格兰医学杂志上报告应用一套被称为“Edmonton方案”的胰岛移植方法，对连续7例有严重低血糖史及代谢不稳定史的I型糖尿病患者进行胰岛移植，同时进行无糖皮质类固醇的免疫抑制治疗，所用药物包括sirolimus、tacrolimus和daclizumab。分离胰岛的方法为经导管用纯化的冷胶原酶灌注并消化，在无异种蛋白的介质中纯化，然后用经肝门脉栓塞法立即移植。移植后7个病人均实现了胰岛素自给，未再发生低血糖昏迷，在随访过程中患者的血脂水平无显著升高。Shapiro等分析了她们成功的原因，认为在于他们1）采用了非糖皮质激素类免疫抑制剂；2）提高了移植细胞的数量；3）采用不经过组织培养的新鲜胰岛细胞。此方案一经公布，当时的美国克林顿总统立即宣布出资500万美元在北美和欧洲的10个中心重复Edmonton的治疗方案。该方案的成功一方面提示了同种胰岛移植的可行性，同时也凸显了两个不容忽视的问题，即1）病人需要终身使用免疫抑制剂；2）每个病人需要2~3个供体，而事实上根据器官共享联合网（United Network for Organ Sharing）的报告[22]，每年能够获得的尸体胰腺不超过6000个，而根据青少年糖尿病基金会（Juvenile Diabetes Foudation）估计，每年被诊断为I型糖尿病的新病例就多达30，000人，因此如何获得那么多的供体胰岛任重而道远。
就异种胰岛移植而言，虽然能够解决胰岛量的问题，但随着近年口蹄疫、疯牛病等疾病的出现，人们对于异种移植的生物安全性问题心生顾虑，并且微囊化免疫隔离也仍未达到临床应用的水平。相对而言，干细胞移植在血液干细胞和皮肤干细胞方面取得的成功以及胰岛干细胞研究本身取得的初步成绩则给I型糖尿病的治疗带来了前所未有的新希望。这是因为1）干细胞免疫原性弱，机体排斥反应低；2）胰岛细胞可体外人为控制扩增代数，细胞量不受限制。因此，总体而言，同种异体胰岛移植是现实的选择，干细胞治疗是明天的希望。 |
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